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    公开号:WO1988000972A1
    申请号:PCT/JP1987/000543
    申请日:1987-07-24
    公开日:1988-02-11
    发明作者:Nagataka Yamazaki；Yoshifumi Yamazaki
    申请人:Taiyo Kagaku Co., Ltd.；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 シ ャ 卜 ルべ ク タ ー 用 D N A
    [0002] 技 術 分 野
    [0003] 本発明 は動物細胞用 べ ク タ ー と レ て 使用 す る こ と の で き る D N A に 関 する も の で ぁ る 。 更 に 詳 し く は 、 大腸菌 、 枯草菌な ど の原核細 胞ぁ る ぃ は酵母な ど の原始的真核細胞 に 固有な プ ラ ス ミ ド と 耝換ぇ プラ ス ミ ド を作 り 、 こ れ ら の細胞中及ぴ動物細胞 中で 自律増殖能カ を持っ シ ャ 卜 ルべ ク タ 一 と し て 機能す る こ と が 可 能で ぁ り 、 目 的 と す る外来性の遺伝子を組み込んで原核細 胞ま た は真核細胞 に 導入 し た と き染色体外で 自 律複製 し 、 更 に 真核細胞 に ぉ ぃ て 該目 的遣伝子 を発現 さ せ る こ と が 可 能な D N
    [0004] A に 関 する 。
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] プラ ス ミ ドゃパ ク テ リ ォフ ァ ー ジ の D N A に 外来性の遺伝子 を耝み込み、 こ れ をべ ク タ ー と し て 用 ぃ て 大腸菌 、 枯草菌等を 形質転換 し 、 目 的の遺伝子を発現さ せ る こ と に ょ り 有用物質を 産生 す る 技術 は すで に ェ業化の段階に達 し て ぃ る 。 こ の方法 に ょ り 有用 物質の産生 に成功 し た例 と し て は 、 こ れ ま で に 大腸菌 に ょ る ィ ン ス リ ン 、 成長ホル モ ン等が ぁ る しか し なが ら 、 大腸菌な どの原核細胞を用 ぃて有用物質、 特 に動物細.胞起源の物質を産生させょ ぅ と意図 し ても 、 該原核細 胞に は、 グ リ コ シル化等の物質俊飾機構又は細胞外への分泌系 が欠けてぃる為に 、 目 的 と する有用物質を得る こ とが困難でぁ る 。 こ れに対 し て、 動物細胞はこれら の機能を備ぇてぃる点で 大腸菌等に代る 主細胞と して有望ではぁるが 、 こ れまでの処 大量の有用物質を得る 目 的に適し た動物細胞用 べク タ 一 は開発 されて ぃなぃ 。
    [0007] 現在、 動物細胞用 べク タ 一 と しての可能性をも っ てぃるもの に S V 40ぉょぴその改良型 S V G T - 5'、 ポリ 才ーマゥ ィルス、 パピ ロ 一マゥ ィ ルス等の D N A がぁる α
    [0008] し か し こ れ ら の D Ν Α は、 核染色体に組み込まれて し ま っ た り 、 細胞ぁた り のコ ピー数が少なか っ た り 、 また はコ ピー数が 多ぃ場合は宿主細胞を殺 し て し ま ぅ等の欠点を 1っ 以上有 し て ぉ り 、 有用物質産生を百的と し たべ クタ ー と して は好ま しぃも のではなぃ。
    [0009] そこで、 この ょぅ な性質を持ち 、 かっ 、 大腸菌等の原核細胞 と動物細胞の どち ら の細胞中でも自律増殖できるべ ク タ ー、 ぃ ゎゅるシ ャ 卜ルべク タ ーを構成し得るべク タ 一の開発が強く 望 ま れて ぃる 。 何故な ^ら ば、 その ょ ぅ なシ ャ 卜 ルべク タ 一 を使用 す れば 、 そ れ に 耝 み込ん だ外来性の遺伝子を 大腸菌等の原核細 胞中で大量 に 、 容易 に かっ 極め て 経済旳に 増殖さ せ る こ と が で き 、 ま た こ れ を そ の ま ま 用 ぃ て 動物細胞中 で 、 目 的 と す る 外来 性の遭伝子を発現さ せ る こ と が可 能 に な る か ら で ぁ る 。
    [0010] 宿主細胞 を殺 す こ と が な く 、 コ ピ ー 数 の 多 ぃ プ ラ ス ミ ド 状で 存在 し シ ャ 卜 ルべ ク タ ー と し て 利用 可能 な D N A と し て は 、 特 開 昭 60 - 19492号公報で 開 示さ れ て ぃ る も の が ぁ る が 、 こ の プ ラ ス ミ ド はそ の コ ピ ー 数が約 5 , 000 程度 と 少な ぃ も のでぁ る 。
    [0011] 発明 の 開示
    [0012] 本発明者 は 、 動物細胞 を甩ぃ た 有用 物質の産生 に 好適なべ ク タ ー の 開発 を 目 的 と し て 鋭意研究の結果 、 マ ゥ ス の テ ラ 卜 カ ル シ ノ - マ未分化細胞で ぁ る F 9 細胞由 来の細胞株 F9-28, F9-36 ま た は F9-80 を 培 養後 、 ァ ル カ リ 変 法 （ Birnboin and : Do I y, Nucleic Acids Res. , 7; 1513, 1979)に ょ り 染色体外 D N A を 抽 出 し た の ち 、 セ シ ゥ 厶 ク ロ ラ ィ ド平衡密度遠心法 に ょ り 分綞、 精製 し て 得 ら れた 、 本明細書の特許請求の範囲第 1 項及び第 6 項 に瀕定 す る D N Aが 、 （1)動物細胞を宿主 と し て 核外 に て 律 複製す る ， G)綑胞内 に ぉ ける コ ピ ー数が非常に 多ぃ （ 1 細胞ぁ た り 約 50, 000コ ピー 〉 , (3)宿主細胞 を分化誘導 する と コ ピ 一数 の増幅 （ 約 10倍 ） が認め ら れる ， （4)組み込ま れた 目 的遺伝子を 宿主動物細胞中で発現 し 、 かっその時でも組換ぇ D N Aが該動 物細胞中で染色体外に 安定 して存在 し 自律複製する ， （5〉ぁ る種 の原核細胞のプラス ミ ド と耝換ぇプラスミ ドを作り 、 シ ャ 卜 ル べ ク タ ー と して機能する等の性質を持っ ことを知見し 、 本発明 に至っ たものでぁる ό
    [0013] 即ち 、 本発明の 目 的は、 ポ リ 才ーマゥ ィ ルス D N Aのー部で' ぁ っ て 、 制限酵素 B amH I の ！ J断点を ー端に持ち それを基準と し 、 制陧酵素 K pnl にょ り 約（K06kb及び約 3,Qkb の位置に、 制 限酵素 P vu にょ り約 0.6k b 、 約 1.9kb 及ぴ約 2.1 kb の位置に、 制限酵素 に ょ り 約 0.7kb の位置に、 制展酵素 B g l にょ り約 0.9kb の位置に 、 制限酵素 E coR I に ょ り約 2.4kb の位置 に 、 制限酵素 H ind HIにょ り約 2.5 kbの位置に 、 制限酵素 Hi nc Iに ょ り約 3.8kb の位置に各々切断点を有する D N A断片を少 なく とも有する前記 D N A、 ぉょぴポ リ 才 ーマ ゥ ィルス D N A のー部でぁ っ て 、 制暇酵素 _g__ H I の切断点をー端に持ちそれ を基準と し 、 制限酵素 K pn l に ょ り約 0.06kb及び約 3.1kb の位 置に 、 制限酵素 P vuH にょ り 約 0.6kb 、 約 2. Okb 及ぴ約 2.2kb の位置に 、 制限酵素 A cc I にょ り 約 0.8kb の位置に 、 制限酵素 B gl I にょ り 約 1. Okb の 位置 に 、 制 限 酵 素 £_ gR I にょ り 約 2.5 kbの位置に 、 制眼酵素 H ind— Mに ょり約 2.6kb の位置に、 制 限酵素 H i nc 辽 に ょ り 約 3.9kb の位 置 に 各々 切 断点 を有 す る D N A断片を少な く と も有す る前記 D N Aを提供 す る こ と で ぁ る 。
    [0014] 本発明 の も ぅ ー っ の 目 的 は 、 上記 D N Aの製造方法を提供 す る こ と で ぁ る 。
    [0015] 本発明 の更 に も ぅ ーっ の 目 旳は 、 上記 D N Aを組み込ん だ組 換 ぇ プ ラ ス ミ ド及ぴ該プラ ス ミ ド を 含む形質転換菌 を 提供す る こ と で ぁ る 。
    [0016] 以下 、 本発明 を更に 詳 し く 説明 す る 。 本発明 の D N Aを そ の — 部 に 含む小環状 D M Aでぁ る T Y A — I ぉ ょ び T Y A — E'は 培養動物細胞か ら 得 ら れる 。 例 ぇ ば、 マ ゥ ス の テ ラ 卜 カ ルシ ノ — マ F 9 細胞 を 、 限界希釈法に ょ り 96穴プ レ ー 卜 5枚 に ま き ダ ルべ ッ コ 変法 Μ Ε Μ培地 （ 10% FCS)に て 約 1週鬮 37Cで培養す る 。 得 ら れ た 単離細胞 に 、 ァル カ リ 変性液 （ 0.2N水酸化 ナ 卜 リ ゥ ム ， 1 % ドデ シル硫酸ナ 卜 リ ゥ ム （ S D S ) ) を加 ぇ遠心分 離 （1500 Γ. p. I , 10分 ） し て 、 D N Aを得る 。 こ の D N Aを 0.8% ァガ ロ ー ス電気泳動法で 、 分子サィ ズの差 に ょ っ て 分離す る 。 分子サィ ズの小 さ ぃ D N A ( T Y A - I ) の みが得 ら れ た 培養 細胞株を F9-28 , 分子 サィ ズの大きぃ D M A ( T Y A — I ) の みが得 ら れ た 培養細胞株 を F 9 -36, 両方の D N Aが得 ら れ た 培 養細胞株を F 9-δΟと命名 し た。
    [0017] 上記の Τ Υ Α— Ι及び Τ Υ Α— Ιの分子サィ ズは ァガ 口 ー ス ゲル電気泳動法に ょ り 測定 する と各々約 5.3kb 及び約 5.4kb で ぁる こ とが分か っ た 。 T Y A— ェ と T Y A— 互 の分子サィ ズの 違ぃ は制眼酵素 P vu g及ぴ A cc I に ょ っ て生 じ る D N A断片の 長さ が T Y A— 辽 にぉぃ て T Y A— Iの約 2倍に な っ てぃる こ と に ょ る 。
    [0018] 各種制限酵素処理に ょ り 、 T Y A— I は制限酵素旦 _§JH I の 切断点を基準と し 、 制限酵素 K pn I に ょ り 約 0.06kb及ぴ約 3.0 の位置に、 制限酵素 £J01 にょ り約 0.6kb 、 約 1.9k b 及ぴ約 2.1k の位置に、 制限酵素 A cc I に ょ り 約 0.7kb の位置に、 制 陧酵素 B gl I にょ り約 0.9kb の位置に 、 制限酵素 Γ にょ り 約 2.4kb の位置に 、 制限酵素 H ind Iに ょ り約 2.5kb 及び約 4.6k の位置に、 制限酵素 J±l _ITにょ り約 3.8kb 及ぴ約 4.1 kbの位置に各々 切断点を有する こ とが判る 。 ま た 、 T Y A— E は制限酵素 H I の切断点を基準と し、 制限酵素 _LQ Iにょ り 約 0.06kb及び約 3.1kb の 位 置 に 、 制 限 酵 素 P vu ϋ にょり 約 0.8kb 、 約 2. Okb 及ぴ約 2.2kb の位置に 、 制限酵素 A cc I に ょ り 約 0.8kb の位置に 、 制限酵素 B g I I に ょ り 約 1. Okb の位置に、 制限酵素 E co R I に ょ り 約 2.5kb の位置に、 制限酵素 H i nd I に ょ り 約 2.6kb 及び約 4.7kb の位置 に 、 制 限酵素 H inc Π に ょ り 約 3.9 kb及び約 4.2kb の 位置 に 各 々 切断点を 有 す る こ と が 判 る 。
    [0019] 上記の T Y A— I 及び T Y A— ！ [ を ポ リ 才 ー マ ゥ ィ ル ス D N A と 比較 す る と 、 制 限酵素 H I を 基準点 と し た と き 制 限酵 素 E CO R I , K n I ， H i nc Iの 切 断点 に っ ぃ て は ほ ぼ周 じ 位 置で ぁ る が 、 P vu II の 切 断点 は ポ リ 才 一 マ ゥ ィ ルス D N Aが 4 ケ 所でぁ る の に 対 し 、 T Y A— I , T Y A— Eで は 3ケ 所で ぁ り 、 E_M辽 切 断点が 1ケ 所欠失 し て ぃ る 。
    [0020] ポ リ 才 ー マ ゥ ィ ルス類似構造を も っ べ ク タ ー に は 、 他の 動物 細胞用 プ ラ ス ミ ド性べ ク ダ - ( 特開 昭 60 - 19492 ) が ぁ る 。 L F I , L F Π と 呼 ばれる こ のべ ク タ ー に は 限酵素 Β g I I に ょ り 切 断点が な ぃ が 、 本発 明 の T Y A— I及ぴ 丁 丫 八 ー 11 に は こ の 酵素 に ょ る 切 断点が 存在 す る 。 ー 方 、 L F I 及 び し F I に は S al I 切 断部位 が存在 す る が 、 本発明 の T Y A— I及び T Y A ― I に は こ の 切 断点 は存在 しな ぃ 。
    [0021] 次 に コ ピ ー 数 を ァ ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 法及 ぴ サ ザ ン 分 析 法 ( Southern E. , J. Mo I . Bioに ， 98, 503 , 1975 ) に ょ り 測定 す る と 、 T Y A— Iぉ ょ ぴ T Y A— E は 1細胞ぁ た り 約 50, 000コ ピ ー で ぁ る こ と が判 る 。 上記 T Y A - I ま た は T Y A— Iは、 マ ゥス F9-28, 36ま たは 80培養細胞株から S D S—プ ロ テ ィ ナ一ゼ K法 （ Bl i n, N. , and ひ. W. Stafford , Nucleic Acids Res. , 3, 2303 , 1976 )に ょ り 抽出 し た D Ν Αをァガ ロ ー ス電気泳動法にょ り 分子サィズの異 なる D N Aを分離 し た のちサザン分析法で調べる こ と にょ っ て、 宿主細胞核染色体に組み込ま れず、 核染色体外に自律複製可能 な小環状 D N A と し て存在 して ぃ る こ とがゎかる 。
    [0022] 上記 T Y A— I又は T Y A— I は、 大腸菌のプラス ミ ドべク タ ー PU C 19と組換ぇプラスミ ドを作り 、 大腸菌内で増殖可能 である 。 これは以下の実験で確め ら れる 。 T Y A— I又は T Y A— Iを S_ iH I で切断し て得た直鎮状の D N Aと、 B_am H. t で切断し たべ ク タ 一 U C 19をラ ィゲーシ ョ ン し組換ぇプラス ミ ド PT Y A— I また は PT Y A— I [ を作製する α こ れを大腸 菌 J M 83に 卜 ランスフ ォ 一メ 一シ ョ ン し 、 形質転換菌 J M 83- ェ ま た は J M 83— Iを得た。 この形質転換菌を大量に培養し、 集菌 し た翱胞から D N Aを抽出 し 、 セシ ゥムク ロ ラィ ド平衡密 度遠心法に ょ り染色体外 D N Aだけを分雄し た と ころ大量の D N Aが検出された α
    [0023] 図面の簡単な説明
    [0024] 第 1 図は Τ Υ Α— ： [ の制限酵素地図を示す。 第 2 図 は Τ Υ Α — Π の 制 限酵素地図を示す 。
    [0025] 第 3 図 は耝換 ぇ プ ラ ス ミ ド PT Y A E を 示 す 。
    [0026] 第 4 図 は耝換ぇプ ラ ス ミ ド PF 9 — C A Tを示す 。
    [0027] 産業上 の利用 可 能性
    [0028] 本発明 の D N A は 、 大腸菌のプ ラ ス ミ ド と 耝換ぇプラ ス ミ ド を作 り 、 シ ャ 卜 ルべ ク タ ー と し て 機能す る 。 す な ゎ ち 、 本発明 の D N Aで ぁ る 、 T Y A — I 又 は T Y A — I の B am H I ― H i nc D N A断片 と 、 大腸菌プ ラ ス ミ ド PB R 322か ら の ^_jH I -; P_VJJ I D N A 断 片 を ラ ィ ゲ ー シ ョ ン し て 複 合 プ ラ ス ミ ド (PT Y A E ) を作製する 。 PT Y A E を大腸菌 に 卜 ラ ジ ス フ ォ ー メ 一 シ ョ ン し 培養 す る とダ厶 メ チ レ ー シ ョ ン （ dam met y I a- tion) さ れた 複製 pTYAE D N Aが得 ら れる 。 次 に こ の pTYAE D N Aを集め 、 マ ゥ ス L T k— 細胞 に 卜 ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し て 培 養す る 。 マ ゥ ス L T k ' 細胞か ら 得 ら れた 染色体外 D N A に っ ぃ て サザ ン分析を行な っ た と こ ろ 、 そ の複製 pTYAE D N A は メ チル化さ れて ぃな か っ た 。 動物細胞中 に はダム メ チ ラ ー ゼ は 存在 し な ぃ の で 、 こ の こ と か ら 、 PT Y A E はマ ゥ ス し T k _ 細胞中に ぉ ぃて も染色体外で D N A複製能カ を有す る こ と が判 明 し た 。 従 っ て 本発明 の D N Aは、 大腸菌の プ ラ ス ミ ド と 組換 ぇ プ ラ ス ミ ド を作 り 、 大腸菌ぉ ょ びマ ゥ ス L T k _ 細胞の 間 で - 1 o - シ ャ 卜ルべ ク タ ー と し て利用 できる こ とが証明さ れる。
    [0029] 本発明の D M Aはま た有用物質産生遺伝子を組み込み、 動勒 翱胞中で染色体外に存在 し 、 上記の 目 的遣伝子を発現 し得るべ ク タ 一 と して搽能する こ とができる 。
    [0030] この点を確認する為に 、 本発明の D N Aを ク ロ ラム フ ェ ニコ ールァセチル 卜 ラ ンスフ ェ ラ ーゼ （ C A T ) 産生遺伝子を有す るプ ラス ミ ド断片 と組換ぇプラス ミ ド を作製し 、 該遺伝子を含 有 し なぃ F 9 細胞株にこれを 卜 ラ ンス フ ェ ク シ ョ ン して 、 該遣 伝子の発現の有無を諝べた。
    [0031] すなゎち 、 T Y A— I または T Y A— ϋを _i_j H I 及び IIにょ り切断し て得 ら れる本発明の D NJ A断片、 大腸菌プラス ミ ドべ ク タ ー B R 322 か ら得ら れた B aiH I - P vul D A 断片ぉ ょびク ロ ラム フ ェ ニ コ ールァ セチル 卜 ラ ス フ ェ ラ ーゼ ( C A T ) 産生遺伝子を有するブラスミ ド D N A (PS V 2 C A T ) か ら得ら れた丘 _ ϋ1Γー B aniH I D N A断片をラィゲーシ ョ ン し て組み換ぇ体 D N A ( PF 9 C A T ) を作製する。 D F 9 C A Tを F 9 細胞株 （下 9 T k " 細胞 〉 に 卜ランス 7ェ クシ ョ ン し 、 2日間培養し fcのち綑胞抽出液を得る。 この綑胞抽出液 を用 ぃて 才 ー 卜 ラジ才グラフ法に ょ り ァセチルク ロ ラム フ ェ ニ コ 一ルの有無を調べ fc桔果、 P F9 C A Tを導入し fc F 9 T k ' 細胞 に ぉ ぃ て ァ セ チル ク ロ ラ 厶 フ I ニ コ ー ルの産生 が 認 め ら れ た 。
    [0032] 従 っ て 、 動物細胞を宿主細胞 と す る 系で本発明 の D N A を上 記の シ ャ 卜 ルべ ク タ ー と し て用 ぃ る こ と に ょ っ て 、 有用物質産 生能が飛躍 旳 に 向上 す る こ と が期待 さ れる 。
    [0033] 更 に 、 本発明 の D N A を有 す る未分化細胞 を分化誘導剤 を 用 ぃ て 分化誘導す る と 、 コ ピ ー 数が増幅 さ れる 。 す なゎ ち 、 F 9- 28株 に 分化誘導剤 を加 ぇ て 培養す る 。 添加後経 日 的 に細胞か ら D N A を抽 出 し 、 核染色体外 D N A 量をサザ ン分析 し た と こ ろ 、 分化誘導剤 添加 4日 目 の細胞 に 分化誘導剤 で処理前の約 10倍量 ( 1 細胞 ぁ た り 約 50, 000コ ピ ー か ら 約 500, 000 コ ピ ー 〉 D N A が認 め ら れ た 。
    [0034] 分化誘導剤 と し て は公知 の任意の も の を適当量で使用 す る こ と が で き る 。 分化誘導剤 と し て は ジブチル サ ィ ク リ ッ ク Α Μ Ρ 及ぴ レ チ ノ ール酸が好適で ぁ る 。
    [0035] 従 っ て 、 本発明 の D N A に 、 外来性の有用 物質産生 遺伝子を 導入 し た 組換ぇ体 D N A を F 9 細'胞 に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し て 培養 し たの ち 、 F 9 細胞を分化誘導す れば 、 有用物質の産生 能が更 に 向上 し ぅ る こ と が容易 に 類推さ れる 。
    [0036] 発明 を実施 す る た め の最良の形態 実施例 Ί
    [0037] 1. Τ Υ Α — I ぉょび Τ Υ Α — ΊΙ の調製
    [0038] (1) マ ゥス F 9細胞か ら ク ロ ーニング した F9-28 培養細胞株を 約 5 X 10 個集めて 2δώの G T E 緩衝液 （ 50mHグルコ ース ， 25 卜 リ ス塩酸 （ ΤΓ ί s— H C )； ΡΗ 8.0， 1mH ェチ レンジ ァ ミ ン 四酢酸 （ E D T A ) ) に懸濁 し 、 の ァルカ リ 変性液 （ひ. 水酸化ナ 卜 リ ゥ ム ， S D S ) を加ぇ 、 ょ く 混和 し、 0°C に て 5 分間放置 した。 更に、 氷冷 した中和液 （ 5H舴酸カ リ ゥム ） 3 を加ぇ、 0°C にて 10分間中和 し 、 遠心分雞（30, 000 Γ. { m. , 30 分 ） した 。 上清に等量のフ I ノ ール、 次に 3倍量のェチルェー テルを加ぇ各-々抽出操作を行な っ た 。 水層に 2.5倍量のェタ ノ —ルを加ぇ D N Aを沈殿させて 3.5 の T E 緩衝液 （lOmH Tr is - C H ： H 7.5S 1mH E D T A ) に て沈殿物を溶解させた。 セシ ゥム ク ロ ラィ ド （ C s C 5 ) 4.15 ぉょぴ b / H ェチジ ゥムァロマ ィ ド 0.5 を加ぇて遠心（50, 000 Γ. [), πκ , 15時間 ） し た。 得ら れたパ ン ドを分取し 、 プチルァルコ ールを加ぇェチジ ゥ厶プロマ ィ ド を除去 した のち 2.5倍量のェ タ ノ ールを加ぇる と 、 約 10 の D N Aが得ら れた α こ の D N A を Τ Υ Α — I と命 名 した。
    [0039] 0 マゥ ス F 9 細胞か ら ク ロ ーニ ングした F9-36 培養細胞株か ら （1〉 と 周様の方法で調製 し D N Aを得 た 。 こ の D N Aを T Y A ー ]! と 命名 し た 。
    [0040] 2. 分子サィ ズの 測定
    [0041] 前記 1 で得 ら れた D N A画分各 l i C ^jjH I ( 10u/^ ) 1 ≠、 10倍 希釈 し た ajjH I 緩衝液 （ 0.5M水 酸 化 ナ ト リ ゥ 厶 ， 0.1M卜 リ ス塩酸 （·ρΗ 7.5), 0.1Μ塩化マ グネ シ ゥ ム ， 10mMジ チ 才 ス レ ィ 卜 ー ル ） 2^ぉ ょ び水 16 を加 ぇ 、 37°C にて 60分間反応 さ せ た 後、 ァ ガ ロ ー ス電気泳動法 （ 0.8¾ァ ガ ロ 一 ス 、
    [0042] ェ チ ジ ゥ ムプ ロ マ ィ ド ） に ょ り 分子サ ィ ズ を 決定 し た 。 サィ ズマ ー カ ー と し て ラ ム ダ （ ス ） D N Aを H ind IEで切断 し た D N A 断片 を用 ぃ た 。 こ の結果 T Y A— I の 分子サィ ズ は約 5.3 kbで ぁ り 、 T Y A — 1 の分子サ ィ ズ は約 5.4Kb で ぁ る こ と が判 明 し た 。
    [0043] 3. 制 限酵素地 図 の決定
    [0044] T Y A — I , T Y A — I ぉ ょ びすで に 制 限酵素地図 の決定 し て ぃ る ポ リ 才 — マ ゥ ィ ルス 野性型 A2株 D N A各 に 10ュ ニ ヅ の制限酵素 B am H I , E co R I ， B g I I , H ind I , K pn I , P vu I , S_a] I , A_cc I 及び H inc I を加 ぇて 切 断 し 得 ら れた 各 D N A断片を 0.8%〜 1.5%ァ ガ ロ ー ス電気泳動法に ょ り 分離 し た 。 ポ リ 才 ー マ ゥ ィ ルス野性型 A 2 株 D N A断片を マ ー カ ー に し て制 IS酵素地図 （ 第 1 図及ぴ 2 図 ） を作戒 し た。 第 J 図 に T Y A - I の制限酵素地図を 、 第 2 図 に T Y A— IIの制限酵素 地図を示す。
    [0045] 4. コ ピー数の測定
    [0046] F9-28 培養 .細胞株 （ 約 1 X 107 個 ） を リ ン酸緩衝生理食塩水 ( P B S ) で 3回洗淨し 、 10 の N E T緩衝液 （ lOOmH N a C H , 10mM E D T A , 10mH T r i s - H C 5 , pH 7.5) に懸濁 し たの ち 1096 S D Sを加ぇて最終濃度 0.5¾に する 。 次に と なるょぅ にプ ロ テ ィ ナ 一ゼ Kを加ぇ、 十分攬拌し 3Γ0にて 10時 間加温する。 反応液に等量のフ ： c ノ ール液 （ 0.1H TPis-H C ϊ , pH 7.5で飽和 し たもの ） を加ぇ、 十分攛拌 し たのち遠心 し てフ ェ ノ ール扈と水層に分離 した σ フ ノ ールー水境界面から 白色 の不純物が消失する まで フ ェ ノ 一ルで油出 し た 。 水曆に残存す る フ ： Ε ノ ールをェーテル抽出 して除きェタ ノ ールを用ぃて染色 体 D N Aぉょぴ Τ Υ Α — Ι を共沈させた 。 リ ポヌ ク レァーゼ A にょ り R Aを分解 し 、 吸光度 （ 260nm)から D N A含量を測定 し-た。 D N A 10 ¾f を用 ぃ てサザン分析（Southern E. , J. Mol . Bioに 98r 503, 1975 ) を行な っ た a こ の と き染色体 D N A を 3x 106 kbと した。 T Y A— I 1(Γ 個 Ζ細胞、 10a 個 Ζ綑胞、 106 個 細胞に相当する T Y A— I ク ロ ー ン D N A量を対照と し て 、 1細胞ぁ た り の コ ピ ー 数を求め た と こ ろ 約 50，000コ ピ 一 で ぁ っ た 。
    [0047] F 9-36培養細胞株を用 ぃ て 上記 と 周様 に 処理 し て 、 T Y A - I も 1細胞 ぁ た り 約 50 , 000コ ピ ー 存在 す る こ と が判明 し た 。
    [0048] 5. 丁 Y A — I 及び ] I が宿主細胞の核染色体 に 耝 み込 ま れ て ぃ な ぃ こ と の証明 ' ·
    [0049] F 9-28培養細胞株か ら S D S — プ ロ テ ィ ナ ー ゼ ！< 法 （ Bl in N. andO. W. Stafford, ucleic Acids Res. , 3, 2303, 1976) に ょ り 抽 出 し た 染色体 D N A及び染色体外 D N Aを ァ ガ ロ ー ス 電気 泳 動 法 に ょ り 分 離 し た 。 次 に 、 T Y A — I の H I ― H inc H D N A 断片 を 精製 し 、 ニ ッ ク 卜 ラ ン ス レ ー シ ョ ン 法 ( Han i at i s, Proc. Nat I . Acad. Sc i . U.S.A. 72:114, 1975 ) に ょ り 32 Pで放射性標識 し て 得 ら れた 、 T Y A - I に枏補 的な D N A断片プ ロ ーブを用 ぃ て サザ ン分析 を行な っ た 。 T Y A — I に 相補的なプ ロ ープ は 、 核染色体 D N A とハ ィ ブ リ ッ ド を形 成 し な か っ た 。 こ の こ と か ら T Y A — I は F 9-28培養細胞株の 核染色体 に 耝み込 ま れて ぃ なぃ こ とが証明 さ れた 。
    [0050] F 9-36培養細胞株に っ ぃ て も周様の処理を施 し 、 T Y A - I がそ の核染色体に組み込 ま れて ぃ なぃ こ と が判 明 し た 。 F 9-80 培養細胞株 に っ ぃ て も周様な結果を得た 。 r 実施例 2
    [0051] 原核細胞のプラ ス ミ ド と組換ぇプラス ミ ドを作り大腸菌内で 自律複製する こ と の証明
    [0052] T Y A— I を ^JJ H I に ょ り 切断 し 、 澴状 D N Aを直鎖状態 に し て 、 ァ ン ピシ リ ン耐性遺伝子を持っ プ ラ ス ミ ドべ ク タ ー PU C 19の B amH I 部位 に ク ロ ー ニ ン グ し た こ の D N A を PT Y A — I と命名 し た 。 この ΟΤ Υ Α— IIで大腸菌 J M 83を 卜 ラ ンス フ ォ ー メ ー シ ョ ンさせた形質転換菌を J M 83- II と命 名 した 。
    [0053] 即ち 、 T Y A— I HD N Aを B amH I 反応'液中にて 、 B_am H I 5ュニ ッ 卜で 3 G、 1時園反応させた 。 PU C 19も周様に し て B amH I で処理 し た 。 両 D N Aを フ ェ ニ一ル処理し 、 ェタ ノ ール沈殿に ょ り 、 D N Aを精製 し fc。 両 D N Aを結合するた め に 、 ラ ィ ゲ一 シ ョ ン緩衝液 （ SOmH Tris-H C 5 H 7.4, 10mH g C 5 2 , 10mH P T T , 1mHA T P ) 中 にて 、 T 4 D N A リ ガーゼ 2.5ュニ ッ 卜を加ぇて 、 16で 、 1時間反応させた。 次に C T液 [ 50mHC a C 4 2 , 10mH Trf s-H C H pH 8, 0]で 0°G、 20分 P 処理し た大腸菌 J M 83 ^ Qf に こ の 結合 し た D N A を 加ぇて、 0°Cにて 2分， 3 Cにて 3分， 0で に て 5分の処理を 行なぃ 、 L-Broth [ ボ リ ぺ プ 卜 ン 1% , 酵母ェ 'キス 0.5%， N a C ί 0.5%] を こ れ に 加 ぇ て 37°C 、 60分間培 養 し 、 ァ ン ピ シ リ ン 50 ¾! / を 含む L-Broth 寒天 上 に 卜 ラ ン ス フ ォ 一 ム し た 大腸菌を ぬ り 込み 、 37°C で ー晚培養 し た 。 寒天上 に ァ ン ピ シ リ ン に 耐性な コ ロ ニ - を 取 っ て 、 1.5 の ぃ Broth で 各 コ ロ ニ ー を培養 し 、 こ れを遠心 （ 10, 000 p. I , 10分 ） し て 集菌 し 、 菌体を S T E — 1 緩衝液 （ 8% シ ョ 糖 、 50mH Tri s-H O H ； H 8.0 、 50mH E D T A ) で洗净 し た の ち 、 S T E T ( 5% 卜 ラ ィ 卜 ン X -100含有 S T E — 1 緩衝液 ） に 溶解 し て ノ i リ ゾ チ ー ム を 1 ^添加 し 室温 に て 放 置 し た 。 溶 菌 さ せ た 菌 体 液 を 100 で で 1.5分間処理 し 、 遠心分離 （ 30, 000 p. m. , 30分 〉 し て そ の上清を得た 。 こ の上清 に 等蠆のィ ソ プ ロ ピル ァ ル コ ー ル を加 ぇ 、 室 温で 30分間放置 し て D N A を 沈殿さ せ た 。 沈瀕物 を 3.5 の Τ Ε 緩衝液 に溶解さ せ て セ シ ゥ ム ク ロ ラ ィ ド 4.15 、 5 ( / ^ ェ チ ジ ゥ 厶 プ ロ マ ィ ド 0.5 を 加 ぇ 、 遠 心 分 離 ( 50, OOOr. p. m. , 15時間 ） す る と 、 約 の D N A が得 ら れた 。 こ れ を ^JJ H i で 消化 し 、 PU C 19内 に T Y A — E が 存在 す る こ と を確認 し た 。 こ の結果か ら T Y A — I は大腸菌のプ ラ ス ミ ド べ ク タ ー PU C 19と 耝換ぇプラ ス ミ ド （PT Y A — 1 ) を作 り 、 大腸菌内で 自 律増殖す る こ と が証明さ れた 。
    [0054] T Y A — I を甩ぃ た 実験 に ょ っ て も 、 Τ Υ Α — ΙΓ の 場合 と 同 様の操作に ょ り 、 T Y A — I が PUC19と耝換ぇプラスミ ド を作 り 、 大腸菌内で自律増殖する こ と が証明さ れた 。
    [0055] 実施例 3
    [0056] 本発明の D N Aが原核細胞のプラス ミ ドと組換ぇプラス ミ ド を作 り 、 シ ャ 卜ルべク タ ー と して機能でき染色体外で自律増 殖する こ と の証明 ■
    [0057] T Y A — I に ^！ |H I - H i nc I 反応液 （ 50mH塩化ナ 卜 リ ゥ ム 、 "lOmht Tr i s - H C H ： pH 7.5 、 10ュニ ッ 卜 B amH I 、 10ュニ ッ ト H i nc E ) を添加 し 、 37°C 、 10分 間 反 応 さ せ た 。 0.8¾ァガ ロ ースゲル電気泳動法に ょ り 、 B amH Γ - H inc I D N A 断片 （ 約 3.8kb)を精製 し た 。 この D N A断片 0.1^と 、 周 様に処理 し て得ら れた ァ ン ピシ リ ン耐性遺伝子を持っプラスミ ド PB R 322の _ H I - P vu I D Ν Α 断片 （ 約 2.3kb) 0.1^ を T 4 D N A リ ガーゼ 2.5ュニ ッ 卜 にょ っ て実施例 2 と周様に 16 , 1時間反応させラィ ゲーシ ョ ン し 、 これを PT Y A E と 命名 し た （ 第 3 図 ） 。
    [0058] PT Y A E を C T液で処理 した大腸菌 （ HB 101 ) に 卜ラ ンス フ ォ ーメ ー シ ョ ン し 、 ァン ピシ リ ン （ 50 / id ) 寒天中で この 耝換ぇプラス ミ ドを有する ク ロ ーンを選択 した 。 この ク ロ ー ン か ら得た P T Y A E 1 と 卜 ランス フ ェ ク シ ョ ン緩衝液（0.1% ー Ί 9 ー
    [0059] デ キ ス 卜 ロ 一 ス 、 140mM 塩化 ナ 卜 リ ゥ ム 、 5M塩化 カ ル シ ゥ ム 、 1mM リ ン 酸水素ニ ナ 卜 リ ゥ ム 、 125 m H 塩化 カ ルシ ゥ ム 、 20mMへ ぺ ス緩衝液 、 PH 7.05 ) を マ ゥ ス細胞株 し T k - ( 約 1 X 106 個 ） に加 ぇ 、 37°Cに て 48時間 C CN ィ ン キ ュ べ ー タ ー 中で培養 し た 。 こ の細胞 か ら ハ ー 卜 法 （ H i rt, B. , J. Mol . Biol. , 26, 365, 1967) に ょ り 染色体外 D Ν Αを 油 出 し た 。 こ の D N A液を M bo I ぉ ょ ぴ D pn I で切 断 し 、 ァ ガ ロ ー ス 電気泳動 法 に ょ り 分 離 し 、 T Y A— Iの ェ ンハ ンサ頜域の D N Aと 相補的な D N A を プ ロ ー ブ と し て用 ぃ 、 サザ ン分析 を行な っ た 。 こ の結果 L T k _ 細胞か ら 得 ら れた D N Aは MJJ9 I に 感受性 を示 し 、 I に 耐性で ぁ っ た 。 こ の こ と は大腸菌でダム メ チ レ ー シ ョ ン さ れ て 、 G A T C配列 の Α部分 が メ チル化 さ れ た Τ Υ Α— Iが 、 ダ ム メ チ レ ー シ ョ ン 活性の な ぃ L T *k _ 細胞 中で 自 律複製 し た fc め 、 D N Aの メ チル基が な ぃ D M Aが増殖 し た こ と を示 し て ぃ る 。 こ の 結果 は 、 本発明 の D M Aが大腸菌のプ ラ ス ミ ド と組換 ぇ プ ラ ス ミ ド を作 り 大腸菌 、 真核細胞の ぃ ず れ に ぉ ぃ て も染色 体外で増幅可 能なシ ャ 卜 ルべ ク タ 一 と し て機能 し ぅ る こ と を 示 し て ぃ る 。
    [0060] T Y A - Iを用 ぃ た 実験で も周様な結果を得た 。 実施例 4 '
    [0061] 本発明の D N A に有用物質産生遺伝子を組み込んで動物細胞 中で目 的遺伝子を発現する こ とができる こ との証明
    [0062] 実施例 3 で作製した組換ぇプラスミ ド PTYAE に C A T産生遺 伝子を組み込んで該遺伝子を発現する こ と に成功 し た α
    [0063] 即ち 、 T Y A — I. に B ai¾H I - H inc I反応液 （ 5 )fflH塩 化ナ 卜 リ ゥム 、 lOniH Tris-H C 5 ； H 7. '5、 10ュニ ッ 卜 B amH I 、 10ュニ ッ 卜 H inc I ) を添加 し 、 37°C、 10分間反応させた 。
    [0064] 0.8% ァガ ロ ースゲル電気泳動法にょ り 、 B amH I - H i nc I. D N A 断片 （ 約 3.8kb)を精製した α 周様に し て 、 PB R 322 の B amH I ー P vul D N A 断片 （約 2.3 kb)、 pS V 2 C A Tの P vu I ― B amH I D N A断片 （ 約 2.5 kb ) を精製し た。 pSV2 C A T P vu I ― B am H I D N A断片をク レ ノ ー （K I enow)反応液
    [0065] ( 50mM Tris-H G H ； H 7.2, lOmH硫酸マグネシ ゥ ム 、 0.1mM ジチ才ス レ ィ ト ール、 1 mM d— ァデノ シン— 5' -三 リ ン酸ニナ 卜 リ ゥム（dATP)、 ImH d -グァノ シン一 5'—三 リ ン酸ナ ト リ ゥ 厶 （dGTP)、 1iiiH d— シチジンー 5'—三 リ ン酸ナ 卜 リ ゥム （dCTP)、 1mH d— チミジ ンー 5'—三 リ ン酸ナ ト リ ゥム （dTTP)、 1ュニッ 卜の E. col ( D N A ポ リ メ ラーゼ I ク レノ ーフ ラグメ ン 卜 ） に 添加 し 、 22°C にて 30分閤反応させた。 このク レ ノ 一処理 D N A 断片 0.1^と 、 pB R 322の B amH I — P vu I D N A 断片 0.1 ぉ ょ び T Y A — I の B am H I ― H i nc E D N A 断 片 0. 1^を 2.5 ュ ニ ッ 卜 の T 4 D N A リ ガ ー ゼを用 ぃ て 実施例 2 と 同 じ ラ ィ ゲ ー シ ョ ン緩衝液中 で 16°C , 1時間反応 さ せ 、 斩 し ぃ耝換 ぇ プラ ス ミ ド を作製 し 、 こ れを P F 9-C A T ( 第 4 図 ） と 命名 し た 。 同様 に し て P F 9- C A T の T Y A — I D N A 断片 を ポ リ 才 ー マ ゥ ィ ル ス 野性株由 来の D N A 断片 に 置 き換ぇ た耝換ぇ プラ ス ミ ド （pP y - C A T ) も作製 し た 。 こ れ ら の組換ぇ プ ラ ス ミ ド を C T液で処理 し た 大腸菌 （ H B 101 )に導入 し 、 ァ ン ピシ リ -ン ( bO/J$ / M ) 寒天 中 で こ れ ら の組換ぇ プラス ミ ドを有 す る ク ロ 一 ン を選択'し た 。
    [0066] F 9 T k " ( T Y A の存在 が認め ら れな ぃ F 9 細胞 ） に上記 ク ロ ー ン か ら 得 た P F -C A T ま た は pP y — C A T各 20 ^を 卜 ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン緩衝液 （ 0.1%デキ ス 卜 ロ 一 ス 、 140mM 塩 化 ナ 卜 リ ゥ 厶、 5M塩化 カ ルシ ゥ 厶 、 1 mH リ ン 酸水素ニ ナ 卜 リ ゥ ム 、 125mM 塩化 カ ルシ ゥ ム 、 201I1IIへ ぺ ス緩衝液 、 pH 7.05)を加 ぇ て C O ゥ ィ ン キ ュ べ ー タ/ー 中 で 37°C に て 5時間培養 し た 。 グ リ セ ロ ール培地 （ 10%牛胎児血清 （ F C S ) — ダルべ ッ コ 変法 M E M培地及び 30%グ リ セ ロ ール ） 3 ^を加 ぇ 、 30秒間放置 し 、 培地で 1回洗净 し て 再び C 02 ィ ン キ ュ べ ー タ ー 中で 37°C , 2 日 間培養 し た （ D N A 卜 ラ ンス フ ェ クシ ョ ン 〉 。 上記の ょ ぅ に D N A 卜 ラ ンス フ ェ ク シ ョ ンさせた細胞を集め、 100mM Tris- H C ( PH 7.8) に溶解 し凍結融解を 3回镍り 返した。 次に超 音波発生璣 （sonif ier)で 5分間処理し たのち 、 遠心分離 (15000 r. p. m. , 10分 ） し て上清液を得た 。 この上清液 に 4mH ァ セ チル C 0 A iOl と 、 14 C 一 'ク ロ ラ ム フ I ニコ ール 1.5 を加 ぇ、 37 にて 1時間反応させた。 これを酢酸ェチル抽出 し 、 群 酸ェチルを滅圧除去し た。 薄扈ク ロマ 卜グラフ法にょ り 、 ク ロ ラ ム フ ェ ニコ 一ルと ァ セ チルク ロラム フ ェ ニコ 一ルを分維 し 、 才ー 卜 ラジ才グラフ法にょ り 活性測定を行な っ た と ころ、 PF9- C A Tが導入された細胞か ら 調製し た抽出物に ァせチルク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ールの強ぃ活性が認め ら れた。 こ の結果、 本発明の
    [0067] D N A に外来性遣伝子 （ C A T産生遺伝子 ） を組み込みマゥス F 9 細胞内で目 的遺伝子を発現 し 、 る こ と が証明された 。
    [0068] 丁 Y A — I を用 ぃた実験に ょ っ ても周様に外来遣伝子を耝み 込みその遺伝子をマ ゥス F 9 細胞内で発現 し ぅ る こ とが証明さ れた。
    [0069] 実施例 5
    [0070] 宿主細胞を分化誘導させるこ と に ょ り T Y Aの コ ピ一数が増 幅されるこ との証明 F 9-28培養細胞株を新鮮な 10% F C Sー ダルべ ッ コ 変法 M E M培地 に 懸濁 し 、 1 0 _3Mジ ブチルサィ ク リ ッ ク A M Pぉ ょ び 0 -'M レ チ ノ ー ル酸を加 ぇ 、 37。Cに て C 02 ィ ン キ ュ べ ー タ ー 中 で培養 し た （ 分化誘導 ） 。 添加後 0, 2, 4, 5, 6, 8日 目 の 細胞 を集 め て 、 S D S — プ ロ テ ィ ナ ー ゼ K法 に ょ り 染色体及び 染色体外 の D N Aを 抽 出 し た 。 実施例 1 の 4 に 記載の如 く 、 各 々 の抽 出液の染色体 D N A含量 を測定 し た の ち 、 10¾ίの染 色体 D N Aを 含む各抽 出 液を分取 し た 。 こ の こ と に ょ り 、 ー定 の細 胞 に存在 す る Τ Υ Α— Ι コ ピ ー 数を比較で き る 。 Τ Υ Α— I に 相補的な D N A断片をプ ロ ー ブ と し てサザ ン 分析 を行な っ た と こ ろ 、 4日 目 にぉ ぃ て 該プ ロ ー ァ と ハ ィ ブ リ ダィ ズ し た D N A 量が操作前の約 10倍で ぁ っ た 。 こ の こ と か ら 、 Τ Υ Α— I を導 入 し た 宿主細胞を分化誘導す る こ と に ょ り 、 Τ Υ Α— Iの コ ピ ー 数を 増幅 さ せ る こ と が 可 能で ぁ る こ と が判 明 し た 。
    [0071] 又 、 F 9-36培養細胞株を用 ぃ だ実験 に於ぃ て も Τ Υ Α— ϋ に っ ぃ て 周様 な結果を得た 。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1 . ポ リ 才 ーマゥ ィ ルス D N Aのー部でぁ っ て、 制限酵素 B am H [ の切断点をー端に持ちそれを基準と し 、 制限酵素 Iに ょ り 約 0.06kb及ぴ約 3. Okb の位置に 、 制限酵素 P vuII に ょ り 約 0.6kb 、 約 1.9kb 及ぴ約 2.1kb の位置に 、 制隈酵素 A cc I にょ り 約 0.7kb の位置に 、 制限酵素 B g I I に ょ り 約 0.9kbの位置に 制限酵素 E coR I に ょ り 約 2.4kb の位置に 、 制限酵素 H ind I に ょ り 約 2.5 kbの位置に、 制 ¾酵素 H inc IIにょ り 約 3.8kb の 位置に各々 切断点を有する D N A断片を少な く とも有する前記 D N A o
    2 . 前記制陧酵素 _ }H I の切断点をー端に持ちそれを基準と し 、 更に 、 制限酵素 H inc Iにょ り 約 4.1kb の位置に 、 制限酵 m ind IEにょ り 約 4.6kb の位置に各々切断点を有する請求の 範囲第 1 項に記載の D N A a
    3 . 分子サィ ズが約 5.3kb でぁる請求の範囲第 1 項又は第 2項 のぃずれかに記載の D N A。
    4 . マ ゥス F 9 翱胞から得 ら れる小環状 D N Aでぁる こ と を特 徴とする請求の範囲第 1 項なぃ し第 3項のぃずれかに記載の D
    N A 0
    5 . マ ゥ ス F 9 細胞 が F 9 — 28又 は F 9 — 80培養細胞株で ぁ り 、 Τ Υ Α — I と 命名 さ れる こ と を特徴 と す る 請求の 範 囲 第 4 項 に 記載 の D N A。
    6 . ポ リ 才 ー マ ゥ ィ ル ス D N Aのー部で ぁ っ て 、 制 限酵素 B am H I の 切 断点を ー端 に 持 ち そ れ を 基準 と し 、 制 限酵素 K pn I に ょ り 約 0, 06kb及び約 3.1kb の位置 に 、 制 限酵素 Ρ νιιΠ に ょ り 約 0.6kb 、 約 2, 0kb 及び約 2, 2kb の 位 置 に 、 制 限酵素 A cc I に ょ り 約 0.8kl) の 位 置 に 、 制 限酵素 _£11 に ょ り 約 1.0kb の位 置 に 、 制 限酵素 E coR I に ょ り 約 2.5k の位置に 、 制限酵素 H ί nd ffl に ょ り 約 2.6 k bの位置 に 、 制 限 酵素 H inc Π に ょ り 約 3.9 k b の 位置 に 各々 切 断点 を 有 す る D N A断片を少 な く と も有 ず る 前記 D N A 。
    7 . 前記制 限酵素旦_^！ H I の切 断点をー端 に 持ち そ れ を 基準 と し 、 更 に 、 制限酵素 H inc ϋ に ょ り 約 4.2kb の位置 に 、 制 限酵 素 H ind Π に ょ り 約 4.7kb の位置 に 各々 切 断点を有す る請求の 範囲第 6項 に 記載の D N A 。
    8 . 分子サィ ズが約 5.4kb で ぁ る 請求の範囲第 6項又 は第 7項 の ぃず れか に 記載の D N A 。
    9 . マ ゥ ス F 9 細胞 か ら 得 ら れ る小環状 D M Aで ぁ る こ と を特 徴 と す る請求の範囲第 6項なぃ し 第 8項の ぃず れ か に記載 の D N A
    10. マ ゥ ス F 9 細胞が F 9 — 36又は F 9 — 80培養細胞株でぁ り 、
    T Y A— I と命名される こ とを特徴 とする請求の範囲第 9項に 記載の D N A。
    11. マ ゥ ス F 9 細胞を培養 し 、 その培養細胞を溶解し 、 ポ,リ 才 ーマゥ ィ ルス D N Aを分雞する こ とを特徴と する D N Aの製造 方法。
    12. マゥス F 9 細胞が F 9 — 28培養綑胞株でぁる こ とを特徴 と する請求の範囲第 1 1 項に記載の方法。
    13. マ ゥス F 9 細胞が F 9 — 3 &培養細胞株でぁる と とを特徴と する請求の範囲第 1 1 項に記載の方法。
    14. マゥス F 9 細胞が F 9 ― 80培養細胞株でぁる こ とを特徴と する請求の範囲第 1 1 項 ^ 記載の方法。
    15. D N Aが T Y A— Iでぁる こ とを特徴とする請求の範囲第 1 2項又は第 1 4項に記載の方法。
    16. D N Aが T Y A— Iでぁる こ と を特徴と する請求の範酒第 1 3項又は第 1.4項に記載の方法。
    17. 钽換ぇプラスミ ド ΡΤ Υ Α— Ι 。
    18. 組換ぇプラス ミ ド ΡΤ Υ Α— I。
    19. 耝換ぇプラスミ ド ΡΤ Y A— Iを含む形質転換菌 J Μ 83—
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    £PS O/LSdV/JDd Π600/88Ο
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    JPS6332487A|1988-02-12|
    EP0278005A4|1989-12-19|
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    法律状态:
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    1988-03-21| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1987904941 Country of ref document: EP |
    1988-08-17| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1987904941 Country of ref document: EP |
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